第一集大战绿妖后，性情温和的彼得·帕克 （ 托比·马奎尔 饰）强忍心痛拒绝了他今生惟一的至爱玛丽·简·沃森 （克里斯汀·邓斯特饰），决定用自己瘦弱的双臂肩负起作为“蜘蛛侠”的责任。两年来，彼得一直忙于应付接踵而来的新挑战，首先，他要学会将超能力使用得收放自如；其次，还得小心翼翼地维持着自己的双重身份，在超级英雄蜘蛛侠和平凡大学生的生活中努力保持平衡。但是双面人的生活十分痛苦，他对玛丽·简的爱火愈燃愈烈，可蜘蛛侠的身份又让他不得不隐匿真情。与此同时，玛丽就像每一个普通人一样有条不紊地继续着自己的生活：她已经实现了自己的演员梦，而且，她的生命中又出现了另一个值得爱的男人——彼得开始认真考虑是否应该放弃秘密身份去大胆表达自己的爱。另外，彼得的好友哈里·奥斯本 （詹姆斯·弗兰科饰）在杀父之仇的驱使下，处处与蜘蛛侠为敌，两个人的关系也因此时刻笼罩在不安中；连一向对他爱护有加的婶婶 （ 罗斯玛丽·哈里斯 饰）也开始怀疑他的真实身份。就在彼得疲于奔命的时候，他又遇到了一个强劲的对手——章鱼博士 （ 阿尔弗雷德·莫里纳 饰），于是彼得学会了命运的意义在于接受而不是逃避，他必须拼尽全力去阻止这个疯子的邪恶计划。

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